轉染可謂是做生物學實驗的大家經常會考慮的一項實驗技術，大致原理也都是明白的。但是在實驗時經常會遇到轉染效率太低，以至于無法進行后續的實驗。

到底轉染是什么呢？

為什么轉染效率不高呢？

其實

轉染，就是在真核細胞里導入具有生物功能的核酸，并在細胞中維持其生物功能。

轉染方法的選擇

我們熟知且常用的轉染方法主要有物理介導，化學介導，生物介導。

物理介導方法：電穿孔法、顯微注射和基因槍；

化學介導方法：如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；

生物介導方法：有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

但實驗室使用較多的主要有化學介導中的脂質體轉染（質粒轉染）和生物介導中的慢病毒轉染法。其中質粒轉染操作簡單，一般瞬時轉染選擇較多，但有些細胞系不容易轉染，因此選擇轉染方式時一定要做足功課，親身經歷告訴我，千萬不要圖方便，否則轉染效率簡直崩潰。特別是養原代細胞的小伙伴，一點要認真選擇！病毒轉染一般具有能夠穩定表達的優勢，且其對原代細胞有較高的轉染效率，其中更分為慢病毒轉染，逆轉錄病毒轉染和腺病毒轉染，其中腺病毒轉染可適合更為難轉染的細胞，例如懸浮細胞、T細胞、raw細胞等難轉染細胞。

轉染的注意事項

01

有血清時的轉染

血清一度曾被認為會降低轉染效率，但只要在DNA-陽離子脂質體復合物形成時不含血清，在轉染過程中是可以使用血清的。

轉染過程在兩步中需要使用培養基做為稀釋液：在DNA-陽離子脂質體復合物準備過程以及復合物同細胞接觸過程。

在開始準備DNA和陽離子脂質體試劑稀釋液時要使用無血清的培養基，因為血清會影響復合物的形成。但在復合物形成后，在加入細胞中前可以加入血清。

陽離子脂質體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此如果你想在轉染培養基中加入血清需要對條件進行優化。

大部分細胞可以在無血清培養基中幾個小時內保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細胞，可以使用一些營養豐富的無血清培養基，或者在轉染培養基中使用血清。

對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用LIPOFECTAMINE 2000。

02

培養基中的抗生素

抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉染的培養基添加物。

這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率低。所以，在轉染培養基中不能使用抗生素，甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣，在轉染前也不必潤洗細胞。

對于穩定轉染，不要在選擇性培養基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養基中細胞的健康生長，使用比含血清培養基更少的抗生素量。

大多數已建立的細胞系都是非整倍體，原代培養包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化，這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發現這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率，融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率。因此，如果觀察到轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復最佳結果。

03

細胞狀態

細胞的生長狀態影響實驗結果，原代細胞和傳代次數多的細胞都不是*，處于對數生長期的細胞生長狀態最好，zui適合轉染。

同時，我們都知道細胞的密度不宜過大，大家往往注意的都是轉染前的密度，失敗過很多次的經歷告訴大家，轉染后的細胞密度更加重要。

有時候轉染時間太久，等到進行后續實驗時細胞已經肆意生長，漂起來了，豈不前功盡棄，流著眼淚也要告訴大家，考慮好細胞的生長周期和轉染的時間進行鋪板，建議選擇50%~80%區間密度進行細胞轉染。

04

細胞鋪板密度

用于轉染的最佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。

一般轉染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2×106-4×106細胞/ml時效果較好。確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。

鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。在三種不同密度進行細胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的，CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應增加了。這些結果說明，對于轉染相同量的DNA所需的最佳陽離子脂質體試劑的量會因細胞密度而異。

05

啟動子的選擇

獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。

CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性，同其他啟動子，如SV40和RSV（勞斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高。

這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細胞）中的CMV啟動子。

SV40啟動子的表達在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。

06

DNA量

高質量的DNA對于進行高效的轉染至關重要。以前研究者使用CsCl梯度離心得到的DNA進行轉染，但是這種方法費時費力。

其他的質粒純化技術如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用*的陰離子交換樹脂純化DNA，可以得到用于轉染的高質量DNA。

另外，Marligen的純化系統實驗步驟很簡單，可以在2小時內完成。

07

瞬時和穩定表達

DNA轉染后，轉入基因的表達可以在1－4天內檢測到。僅有一部分轉入細胞的DNA被轉運到細胞核內進行轉錄并最終輸出mRNA到細胞質進行蛋白合成。幾天內，大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋；一周后就檢測不到其存在了。

瞬時表達分析檢測未重組質粒DNA上基因的表達。因此，表達水平與位臵無關，不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達分析所需的人力和時間比穩定表達少，但因為DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大，實驗必須很小心。

為了進行穩定表達，轉入的基因必須能和細胞同步復制。在轉染的質粒自發整合到宿主基因組上時就會如此。在一小部分轉染的細胞中，加入的DNA通過重組整合到基因組上。包含整合DNA的細胞很少，必須通過對藥物的抗性篩選進行擴增或通過表型變化進行鑒定。

穩定基因表達實驗需要數周，如果需要驗證蛋白產量，所需的時間更長，但得到的細胞系可以做為蛋白生產的穩定來源或用于得到轉基因動物。

08

瞬時轉染和轉染效率的監測

基因的瞬時表達在24-72小時內就結束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質粒表達和監測轉染步驟的效率。

可以使用報告基因來確定優化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）。可以使用簡單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質粒包含CMV啟動子調控下的LacZ基因，轉染入真核細胞內后可以直接表達bgal。結合簡單的檢測步驟，可以做為監測轉染條件的一種方便靈敏的方法。

09

穩定轉染細胞系的篩選

連同帶有藥物抗性的篩選標記基因一起轉染目的基因是建立穩定轉染細胞系zui常用的方法。氨基糖苷磷酸轉移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通過磷酸化使藥物失活，從而提供對GENETCIN選擇性抗生素（G418 Sulfate）的抗性?？股乜剐曰蚩梢耘c目的基因在同一個質粒上，也可以在不同的質粒上。如果兩個不同的質粒同時轉染，兩個質粒都可能整合形成穩定轉化子。對于兩種不同質粒的共轉染，帶有目的基因的質粒和帶有篩選標記的質粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉染的目的基因。

陽離子脂質體試劑提供了一種建立穩定轉染株的高效方法。瞬時轉染效率的改進一般也會提高穩定轉染效率。比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS試劑得到的NIH 3T3細胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數目比單獨使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進行穩定的表達分析，在轉染后次培養細胞，低密度鋪板，給予生長空間，在幾天或數周內保持篩選壓力。

生長的細胞比不分裂的細胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉染后，在開始篩選前等待48-72小時，使細胞表達足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時可以自我保護。轉染后48-72小時倒掉培養基，加入含有GENETICIN抗生素的培養基，抗生素的濃度根據劑量反應曲線確定，足夠殺死未轉染細胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃度，包括細胞類型，培養基和血清濃度等，所以有必要對每種細胞作一個劑量反應曲線，確定最佳濃度。

篩選最多可能需要一周時間，因為在致死劑量的GENETICIN抗生素存在條件下，細胞會分裂1-2次。在次培養細胞時使用較低劑量的抗生素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細胞一般是離散的克隆，根據實驗目的不同，可以分別純化（克?。?，收集進行大量培養或染色并進行抗性克隆的計數。

10

蛋白表達和培養基的選擇

哺乳動物細胞系合成可溶的，翻譯后修飾的蛋白，比細菌，真菌或昆蟲細胞中表達的蛋白更有可能有生物活性。

穩定轉染的細胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時轉染細胞可以快速表達，迅速地合成小量蛋白。常用的細胞系包括CHO，293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S細胞，來源于經篩選轉染效率更高的亞細胞系。這些細胞也可用于無血清和限定化學成分培養基。重組蛋白的大規模生產一般在穩定轉染的懸浮細胞中進行。這些細胞易于生長到高密度并合成更多蛋白，使用基質珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。

用于蛋白生產的細胞的轉染可以在添加有血清或無血清培養基中進行。但更傾向于使用無血清培養基表達蛋白，因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養基一般針對某一特定細胞類型優化并有幾類無血清培養基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養基低得多）。

無蛋白培養基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物，限定化學成分的培養基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇zuishihe您應用的一種。

在含血清時轉染的細胞可以適應無血清培養基，無蛋白培養基或限定化學成分的培養基。在部分情況下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），對于已適應無血清或無蛋白培養基的細胞，可以使用其培養基進行轉染。其他一些無血清培養基包含抑制陰離子脂質體介導轉染的成分，在這些情況下，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養基中進行培養和轉染。

11

轉染效率的驗證

1、較有效的驗證方式必須是qPCR驗證；

2、熒光觀察，使用病毒轉染，明白自己病毒的情況，是熒光標記（一般是GFP）還是非熒光標記。質粒轉染，可以在載體上添加熒光標記，幫助自己通過熒光觀察轉染效率。但是熒光并不能*證明轉染效率，還是通過核酸驗證最為準確。